本文標題："用冰凍碎裂法檢視四膜蟲的細胞膜-細胞顯微鏡"
發布者：yiyi ------ 分類: 站內動態 ------ 人瀏覽過 -----時間：2013-3-25 10:5:21
四膜蟲的分泌物，很明顯地是以一般向量性的合成方法進入質內網，而含有分泌物的大囊泡則由細胞內部移向細胞膜，所以在某些部位會存有一些不再移動的成熟長囊狀泡，其內含物呈結晶形，此囊泡稱為成熟的黏液泡（mature mucocyst）。
用冰凍碎裂法檢視四膜蟲的細胞膜時，我們在黏液泡上發現有由九個小顆粒，圍著一個中央顆粒做環狀排列。（直徑15nm），此一構造我們稱為融合蕊（fusion rosette），這與卡斯提羅及卡茲提出的假定部位相當。
草履蟲絲泡分泌時，也可找到類似的部位，幾個有關草履蟲的實驗，發現有些突變種缺少絲泡，或只在某些溫度下，才釋出絲泡。法國分子遺傳學中心（center of molecular genetics）的貝生（Janine Beisson）、萊佛勸（Marcelle Lefort-Tran）和我，用冰凍碎裂法觀察這些突變種，發現它們缺少融合蕊，或融合蕊很少。這是首次對分泌顆粒遺傳基礎的直接觀察。我們推想融合蕊是融合的必須條件。
我們近的實驗結果，也支持上面的推論，在實驗室裏，我們采用奧斯丁（Austin）德州大學湯姆生（Guy A. Thompson）和他同事的方法，以待布卡因（Dibucanine，一種局部麻醉劑）來處理四膜蟲，發現待布卡因會使所有成熟的黏液泡釋出內容物，而所有的融合蕊也會消失不見，經幾小時甦醒后，才又有成熟黏液泡及融合蕊的出現。
雖然許多原生動物都有融合蕊，但排列的方式卻各不相同，這可能是分泌顆粒大小不同所致。在脊椎動物的細胞膜上較難找到類似的構造。少數脊椎動物和無脊椎動物有此類構造，但不知是否與融合蕊的功能相同。
發現四膜蟲細胞膜上的融合蕊后，我們進一步探討成熟黏液泡的膜與細胞膜上的配對位置（matching sites），冰凍碎裂圖顯示，粘液泡前端的環帶（annulus）是由五、六排顆粒所組成，直徑為10nm，但其頂端60nm直徑大小地帶，并無顆粒存在，這可能就是融合蕊的大小。細胞質中的黏液泡沒有環帶，故推想環帶的形成與黏液泡的成熟有關。
融合膜上顆粒的配對排列，可稱之為顆粒配對群（matching clusters of particles），這些配對群在二細胞間構成緊密接觸的聯結縫（gap junction），穿入相鄰細胞膜的內部，使離子與微小水溶性分子互相流通，而滲透性的改變，在許多系統裏都與排空作用有關。
四膜蟲黏液泡內的結晶形物質轉變成無形質時，即開始融合，然后黏液泡變成長囊狀，直徑有700nm，一般認為這是因滲透性改變，水分流入、內容物溶解所造成的結果。隨著物質的溶解，黏液泡擴脹，釋出內含物，使膜破裂。但一般的電子顯微鏡照片并不能表示膜內的確實排列情形，而只表示分泌泡膜與細胞膜結合的后結果，此時分泌泡看起來像是Ω形，將照片倒過來，就像U形了。
由冰凍碎裂法看到細胞膜的P、E面，可知分泌泡從靜止狀況到Ω出現時，有關膜融合的一些細節，我們應記住成熟黏液泡的幾何構造，是長型、有環帶，且位于細胞膜融合蕊下方。二成對膜的融合，首先在融合蕊中央出現凹下的融合袋（fusion pocket），融合繼續進行，融合蕊的大顆粒會在融合袋邊緣分離開來，使融合袋增寬加深。
若在同一裂面上看到融合袋領襟內緣上有碎裂P面環帶的顆粒，即表示二個半膜上P半邊的融合已經完成。在E面也可看到同樣結果，但因含有通往外界的孔洞，所以較為模糊不清。
成對的膜連合時，細胞膜與黏液泡膜上的裂面，有明顯的球形囊泡及環帶，融合袋破裂后其直徑不超過250nm，所以環帶很可能是用來增強環（ring）的構造，并防止因分泌所造成的細胞膜破裂，同時環帶也是黏液泡湧回細胞內，成為部分細胞膜的支撐點。
因為冰凍碎裂法所拍的顯微照片與生化性質相符，我們可據此擬出融合分泌程序的分子模型，來表示融合時進行的酵素作用，以及顆粒特殊排列的原因。因為只在融合蕊上60nm的光滑地區，及其他黏液泡膜環帶內的光滑地區，才會發生融合，所以融合主要是涉及脂質的變化。倫敦大學的路西（Jack A. Lucy）認為融合常在脂質流動性增高的雙重脂層中發生，而利用磷脂酸（phospholipase）移去脂質的排水端，即可增高流動性。四膜蟲的顆粒環（rings of particles）可能就是受限于流動率的融合區。
我們對膜融合及囊泡分泌的起動機制了解得很少，其基本問題可能涉及細胞質內Ca++增多時，細胞就釋出組織胺。待布卡因就是藉提高細胞質內Ca++的濃度，而造成四膜蟲黏液泡的分泌。
對排空作用的研討，還有一個更大的問題，就是融合后囊泡膜的去向。我們及其他的人都已獲得證據，知道囊泡膜會在融合后成為細胞膜的一部分。因為在四膜蟲的實驗裏，并無囊泡移至細胞質的跡象，反而在融合部位發現了可能是黏液泡膜併入細胞膜的痕跡。國際衛生研究機構的郝哲爾（John E. Heuser）和李斯（Thomas S. Reese）發現，神經末稍的鍵泡若長期接受分泌的刺激，則神經細胞的細胞膜會因鍵泡膜大量的併入而顯著地增厚膨脹。
這種合併的明顯與否，視細胞種類而異。但在正常情況下，鍵泡膜并不會在融合點又發生合併現象，所以膜的增加并不明顯。而且由吸收聚集的膜分子，并不一定在融合時即併入細胞膜，因此融合應視為是細胞膜的換新，只要不同時產生合併，膜融合似乎就是促進細胞膜生長、分化的增進機制。
如果將鹽加入小鴨的飲水內，在短時間內，它們的分泌細胞的體積就已增加百倍。耶魯大學藥學系的巴內撤（Russell J. Barnnett）和他的同伴在高氏體內找到一種細胞膜（Na+－K+ ATPase），后來在小囊泡及新細胞膜上也找到過。他們認為這是因為含有酵素的囊泡，在細胞內擴大而將膜物質，送到細胞膜去。
精冠體分泌后也會促成膜的快速膨脹。但還沒有人知道新精冠體的外膜，有多少是由精冠囊泡轉變形成的，以及有多少是由分子庫（molecular pools）裏重新聚集而成的。在其他許多具生長特性的例子裏（如植物花粉管的形成），囊泡融合對細胞膜的建造及酵素的組成，都很重要。
四膜蟲是以二分法繁殖的單細胞生物，每個細胞週期中（大約四小時），它都必須為子細胞產生足夠的新細胞膜，而且這些新細胞膜必須和原細胞膜一樣（如在子午區重新形成的融合蕊等）。因為許多新細胞膜是由融合的黏液泡膜提供，因此我們認為細胞分裂后的每一融合蕊，都表示一個融合事件，這也可說明新細胞膜的局部增長現象，因為藉以產生局部增長的子午板（meridional template）在新細胞形成時仍保留著
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