本文標題：" 測量細胞培養液中LDH活性的原理"

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測量細胞培養液中LDH活性的原理

細胞死亡率之測定

乳酸去氫醣（lactate dehydrogenase, LDH）為存在細胞漿中之穩定物質。

當細胞損傷時，細胞膜的完整性被破壞，導致 LDH 釋放到細胞外的培養液

中；而LDH的釋放量與細胞損傷程度具有正相關性。因此，藉由測量細胞培養液中 LDH 活性的高

低以代表細胞的死亡率

一、原理

當 LDH 將丙酮酸轉變成乳酸時，還原性輔助醣（NADH；波長

340 nm 有較高的吸光值）亦被氧化成氧化性輔醣（NAD；波長 340 nm

吸光值較低），此反應中具有吸光值之變化。因此，藉由觀察氧化還原

反應中，還原性輔醣之高吸光值隨時間漸減之趨勢而評估乳酸去氫脢的

活性（units/ml）

丙酮酸 + 還原性輔醣 LDH 乳酸 + 氧化性輔醣

（pyruvate）（NADH）（lactate）（NAD）

二、試劑

1. 0.1 M 磷酸緩衝液（Phosphate buffer；PBS）

2. 500 units/ml Enzyme Control 2-E：Sigma

3. 0.3μg/μl β–NADH 溶液

4. 22.7 mM 丙酮酸鈉溶液

三、標準品備制

將 500 units/ml Enzyme Control 2-E（LDH）以 0.1 M 磷酸緩衝液稀

釋成各種不同濃度（500, 250, 125, 62.5 units/ml）之 LDH 溶液，作為

標準品

實驗步驟

1. 取 50μl 樣品或標準品置于 96-well RIA/EIA plate 中，并加入 100μl

β-NADH 后，室溫下避光，反應 30 分鐘。

2. 各加入 100μl Sodium Pyruvate，立即（2 分鐘內）以 ELISA reader 進

行動力（kinatics）學方式分析測讀。設定波長 340 nm，共進行 3 分

鐘測讀，每 30 秒記錄一次吸光值；完成后，ELISA reader 將自動算

出單位時間內吸光值的變化率（△Abs/min），以估算 LDH 之活性。

一單位乳酸去氫醣之活性（1 unit of LDH activity）的定義是指每分鐘

催化 1 mmol NADH 氧化所需 LDH 的量

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